Отдел молекулярных биосистем

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

127276 Москва, ул. Ботаническая 35

 
 
 
 
 
 
 

Лаборатория клеточной регуляции

 
 
 
 
 
 
 
 
 
Лось
Дмитрий Анатольевич

д.б.н., проф.
Зав. лаб.

Дзюбенко
Вячеслав Сергеевич
к.б.н., с.н.с.
Зорина
Анна Алексеевна
к.б.н., с.н.с.
Куприянова
Елена Владимировна
к.б.н., с.н.с. 
Миронов 
Кирилл Сергеевич
к.б.н., с.н.с. 
Dmitry A. LOS
losda[at]ippras.ru
 
 


 
 
Новикова
Галина Викторовна 
д.б.н., в.н.с.
Бачин
Дмитрий Вячеславович 
н.с. 
 
 
 
 

 
 

Молекулярные механизмы холодоустойчивости

В сотрудничестве с Лабораторией липидного метаболизма и Лабораторией зимостойкости ИФР РАН

Холоднокровные организмы часто испытывают изменения параметров окружающей среды, и их способность к выживанию напрямую зависит от адаптационных способностей. Перепады температур и осмолярности внешней среды вызывают изменения в текучести клеточных мембран. Эти изменения являются необходимыми для запуска ответа на стрессовые воздействия, что в конечном итоге и обеспечивает адаптацию. Молекулярные механизмы, отвечающие за восприятие изменения текучести мембран, пока полностью не охарактеризованы. Тем не менее применение новых подходов – метода мутагенеза, направленного на изменение текучести мембран, и анализ экспрессии целого генома с помощью ДНК-микрочипов – позволили значительно продвинуться в понимании механизмов регуляции текучести мембран и идентификации сенсоров, воспринимающих сигналы абиотических стрессов (Vigh et al., 1993Murata & Los, 1997; Los & Murata, 2004Los et al., 2008). Исследована роль полиненасыщенных жирных кислот мембранных липидов в регуляции экспрессии генома цианобактерии Synechocystis  (Inaba et al., 2003Los & Murata, 2004Los & Zinchenko, 2009; Миронов с соавт. 2012).

Десатуразы жирных кислот - это ферменты, образующие двойные связи между углеродным атомами в цепях жирных кислот. Образование двойных связей, в свою очередь, обеспечивает мембранным липидам большую текучесть при низких температурах (Los & Murata, 1998; Los et al., 2013). В лаборатории клонировано множество генов десатураз из разных организмов, включая цианобактерий, охарактеризованы их специфичность и профили экспрессии. Показана светозависимость экспрессии гена омега-3 десатуразы у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 (Mironov et al., 2012) и его индукция красным светом (Mironov et al., 2014).

Гены десатураз из цианобактерий были успешно экспрессированы в высших растениях (табак, разные сорта картофеля). Увеличение степени ненасыщенности жирных кислот мембранных липидов приводило к повышенной холодостойкости и морозоустойчивости растений (Kiseleva et al., 2000Orlova et al., 2003Маали с соавт., 2007Maali et al., 2010; Лось 2014).

 

 

Сенсоры и передатчики стрессовых сигналов у цианобактерий

 В сотрудничестве с Кафедрой генетики МГУ 

У цианобактерий такие консервативные регуляторные белки как гистидинкиназы, регуляторы ответа, серин-треониновые протеинкиназы и сигма-факторы РНК-полимеразы, являются главными кандидатами на роль сенсорных молекул и передатчиков сигналов об изменении в окружающей среде. В геноме Synechocystis имеются 44 гена, кодирующих потенциальные гистидинкиназы, и ещё 3 гена Hiks локализованы в плазмидах. Потенциальные регуляторы ответа представлены на хромосоме 42 генами, и ещё 3 гена находятся в плазмидах. Все эти 47 гистидинкиназ и 45 регуляторов ответа являются кандидатами на роль сенсоров и передатчиков сигналов об изменении окружающей среды. Кроме двухкомпонентных систем регуляции имеются ещё 12 генов серин-треониновых протеинкиназ эукариотического типа и 58 генов, кодирующие транскрипционные факторы. Практически по всем этим генам имеются мутанты и изучается их функциональная роль в стрессовых ответах. Идентифицированы сенсоры низкий температуры (Suzuki et al., 2000), солевого и гиперосмотического стресса (Paithoonrangsarid et al., 2004; Shoumskaya et al., 2005), недостатка марганца (Yamaguchi et al., 2002; Zorina et al., 2016). Показана ключевая роль серин-треониновой киназы SpkA в способности клеток к движению (Panichkin et al., 2006). Ведутся работы по изучению функций других серин-треониновых протеинкиназ у цианобактерий (Zorina et al., 2011; Зорина с соавт. 2014).

Показана важная роль изменений сверхспирализации геномной ДНК в регуляции генов стрессового ответа (Los 2004; Prakash et al., 2009). Результаты исследований обобщены в обзорной статье (Los et al., 2010) и - более подробно - в монографии "Сенсорные системы цианобактерий" (2010).  
 
 

Ионные и водные каналы цианобактерий

В сотрудничестве с Лабораторией мембран растительных клеток, ИФР РАН

Исследована роль механосенсорного ионного канала MscL у пресноводной цианобактерии Synechocystis вусловиях температурных стрессов: при деполяризации цитоплазматической мембраны, вызванной резким изменением температуры окружающей среды или ионофором валиномицином в присутствии K+, MscL служит каналом для выброса ионов Ca2+ из клеток (Nazarenko et al., 2003). Кроме того показано, что MscL функционирует как неспецифический ионный канал, регулирующий, объем цитоплазмы при температурных стрессах (Bachin et al., 2015).  

Единственный ген aqpZ кодирует водный канал Synechocystis,  служащий для быстрого выброса воды из цитоплазмы клеток в условиях гиперосмотического и солевого стресса. Мутанты по этому каналу не могут быстро менять клеточный объем, а эта способность важна для экспрессии генов, необходимых для акклиматизации клеток к новым условиям среды обитания (Shapiguzov et al., 2005). Мутант по AqpZ чувствителен к свету высокой интенсивности, что связано с невозможностью восстановления активности ФС2 (Sinetova et al. 2015).  

Карбоангидразы реликтовых цианобактерий

В сотрудничестве с Институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Основы биосферы современного типа были заложены около 2 млрд. лет назад, в период господства на Земле прокариот. Древние цианобактерии превратили раннюю восстановительную атмосферу в кислородную, связав большое количество СО2 в карбонаты и выделяя О2 в процессе фотосинтеза. Участие циано-бактериального сообщества в связывании атмосферного СО2 на ранних этапах истории Земли подтверждается наличием в осадочных породах строматолитов – слоистых известняковых отложений, представляющих собой литифицированные циано-бактериальные сообщества, аналогичные современным бентосным матам.

В настоящее время формирование строматолитов при участии циано-бактериального сообщества представляет собой незначительный по масштабам процесс, геомикробиологические процессы которого плохо изучены. До сих пор неясно, принимают ли участие в минерализации циано-бактериального сообщества какие-либо физиологические процессы, или оно лишь структурирует естественное осадконакопление. Нами было выдвинуто предположение, что ключевую роль в механизме биоминерализации может играть фермент карбоангидраза (КА), регулирующая равновесие форм неорганического углерода, в том числе и бикарбоната, участвующего в осаждении кальция в природе (Kupriyanova et al., 2007).

Биологическая роль КА, определяемая катализом реакции гидратации-дегидратации углекислоты, весьма разнообразна. Доказано участие фермента в таких фундаментальных процессах как фотосинтез, дыхание, транспорт соединений неорганического углерода и ионов, регуляция кислотно-щелочного баланса. Согласно современной систематике все КА подразделяют на три основных класса (альфа-, бета- и гамма-), не имеющих между собой значимой гомологии в аминокислотных последовательностях и эволюционировавших, вероятно, независимо друг от друга.

В настоящее время КА найдена практически у всех групп живых организмов, где этот фермент участвует в осуществлении ряда физиологических процессов, среди которых есть и идущие с отложением карбоната кальция. Поскольку прокариотам свойственны механизмы внеклеточного отложения карбоната кальция, осаждение которого в живой природе контролируется рН среды, представляется вполне вероятным, что КА, локализованная в наружных слоях цианобактерий, может участвовать в стабилизации рН околоклеточного пространства и минерализации клетки. Таким образом, ферментативная активность КА могла способствовать и образованию строматолитов докембрия  (Kupriyanova et al., 20072011).

Крайне удобной моделью для изучения строматолитобразования могут служить микробные сообщества,  развивающиеся в экстремальных местах обитания, где отсутствуют высшие организмы: термофильные сообщества гидротерм, галофильные сообщества соленых лагун, алкалофильные сообщества содовых озер. Такие сообщества называются реликтовыми и считаются аналогами экосистем прошлого. Также, исследование организации КА системы у реликтовых организмов может представлять интерес для понимания эволюции трех классов КА (Купрянова с соавт., 2003; 2004; Куприянова, Пронина, 2011; Куприянова с соавт. 2013Kupriyanova et al., 200720112013; 2016).

 
 

Взаимодействие путей передачи сигналов фитогормонов в регуляции клеточных процессов, роль МАПК каскадов. 

Мы изучаем взаимодействия путей передачи сигналов фитогормонов в интактных растениях и в культивируемых in vitro клетках. Газообразный фитогормон этилен, находящийся в центре нашего внимания, – глобальный регулятор физиологических изменений, происходящих в клетках растений, как при нормальных, так и при стрессовых условиях. На основании молекулярно-генетических исследований этилен-нечувствительных мутантов Arabidopsis постулировано, что в отсутствие этилена его рецепторы физически связаны с МАПККК CTR1, что ведет к активации этой протеинкиназы. Вследствие работы инициируемого CTR1 МАПК каскада ингибируется активность белков EIN2 и EIN3, и не происходит экспрессия этилен-регулируемых генов. Этот путь получил название линейного пути передачи этиленового сигнала. Полученные нами биохимические данные изменили существовавшие представления. Мы пришли к заключению, что кроме  CTR1-зависимого  у растений работает иной сигнальный путь. Он инициируемый теми же рецепторами, что и линейный путь, но в отличие от последнего он включает мономерные ГТФ-связывающие белки и активируемый этиленом МАПК каскад. Однако нельзя исключить, что могут быть найдены и другие белки, функционирующие при передаче этиленового сигнала, которые отличаются от идентифицированных к настоящему времени  компонентов.

Для изучения взаимодействия путей передачи гормональных сигналов, а именно: исследования роли этилена и АБК в контроле пролиферации клеток, – мы  получили стабильно растущие суспензионные культуры клеток Arabidopsis дикого типа и этилен-нечувствительных мутантов (etr1-1, ctr1-1 и ein2-1). Впервые для in vitro культивируемых клеток показан дифференциальный эффект  АБК на биосинтез этилена, митотическую активность, синтез ДНК, рост и цитодифференцировку. Анализ экспрессии генов, кодирующих МАПК, а также изучение фосфопротеомов клетокetr1-1, ctr1-1 и ein2-1 показали, что кроме влиянии на синтез друг друга, в культивируемых клетках пути передачи сигналов этилена и АБА взаимодействуют, а общим сигнальным компонентом может  быть МАПК MPK6. Таким образом, в биологических моделях, где в результате внешнего воздействия  растет биосинтез этилена, включение пути передачи сигнала АБК необходимо для синтеза ДНК, поддержания митотической активности и клеточной пролиферации

Публикации 

Mur L.A., Mandon J., Persijin S., Cristescu S.M., Moshkov I.E., Novikova G.V., Hall M.A., Harren F.J., Hebestrup K.H., Gupta K.J. (2013) Nitric oxide in plants: an assessment of the current state of knowledge. AoB Plants 5: pls052. doi: 10.1093/aobpla/pls052

Новикова Г.В., Носов А.В., Степанченко Н.С., Фоменков А.А., Мамаева А.С., Мошков И.Е. (2013) Пролиферация клеток растений и ее регуляторы. Физиология растений 60, 529-536.  

Новикова Г.В., Степанченко Н.С., Носов А.В., Мошков И.Е. (2009) В начале пути: Восприятие АБК и передача её сигнала у растений. Физиология растений, 56, 806-823.

Мошков И.Е., Новикова Г.В. (2008) Суперсемейтво мономерных ГТФ-связывающих белков растений. 2. Rab-белки – регуляторы везикулярного транспорта и ответных реакций растений на стрессы. Физиология растений, 55, 127-139.

Новикова Г.В., Мошков И.Е. (2007) Суперсемейтво мономерных ГТФ-связывающих белков растений. 1. Роль белков Rop-семейства в регуляции роста и развития. Физиология растений,54, 932-944.

Moshkov I.E., Mur L.A.J., Novikova G.V., Smith A.R., Hall M.A. (2003) Ethylene regulates monomeric GTP-binding protein gene expression and activity in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol., 131, 1705-1717.

Moshkov I.E., Novikova G.V., Mur L.A.J., Smith A.R., Hall M.A. (2003) Ethylene rapidly up-regulates the activity of both monomeric GTP-binding proteins and protein kinase(s) in epicotyls of Pisum sativum L. Plant Physiol., 131, 1718-1726.

Hall M.A., Moshkov I.E., , Novikova G.V., Mur L.A.J., Smith A.R. (2001) Ethylene signal perception and transduction: multiple paradigms? Biol. Rev., 76, 103-128. 

Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R., Hall M.A. (2000) The effect of ethylene on MAPKinase-like activity in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett., 474, 29-32.